153-2012-0258
摘要
研究人员选择了26只雄性犬，根据它们的临床检查、前列腺超声检查和前列腺活检将其分为四组：（1）正常犬（对照组：n=8）；（2）患有前列腺增生的犬（BPH组：n=8）；（3）患有前列腺炎的犬（前列腺炎组：n=4）；（4）患有前列腺肿瘤的犬（肿瘤组：n=6）。通过造影剂和专用超声系统对前列腺进行检查，可以对正常和患病情况下的前列腺血管进行详细的定性和定量分析，从而可以检测和表征不同的疾病状态，并量化诸如灌注峰值强度的参数（％），造影剂到达可视化强度最大值的时间（达到峰值的时间[TTP：秒]），局部血容量、局部血流量和平均通过时间（MTT[秒]）。患病前列腺组的血流动力学指数TTP（P<0.01）和MTT（P<0.001）显著低于正常前列腺组，尽管疾病之间没有差异。TTP和MTT的最佳临界值分别为31秒（敏感度：72%；特异度：88%）和47秒（敏感度：100%；特异度：88%），而造影曲线下面积分别为0.86（P<0.01）和0.97（P<0.01）。在正常和患病的前列腺之间血管模式的定性评估显示差异。后者的特征是正常血管外观的改变，包括囊下小动脉的丢失和向心血管模式的缺乏。该研究的定性方面突出了BPH，前列腺炎，腺癌和淋巴瘤之间的不同血管结构。这项研究表明，超声造影如何代表一种有效的非侵入性方法，用于突出和表征前列腺血管系统。此外，它允许操作员获得定性和定量数据，这些数据可用于诊断所选的前列腺疾病。总之，超声造影可以成为提高狗前列腺疾病诊断准确性的有价值的非侵入性诊断工具。
介绍
在小动物饲养中经常会发现影响犬前列腺的病理状况。最常见的前列腺疾病是良性前列腺增生（BPH）、前列腺炎、脓肿、囊肿、前列腺旁囊肿，鳞状化生和肿瘤很少见。尤其BPH占病例的50％以上，而感染少于20％，肿瘤为7％，鳞状化生少于2％。前列腺疾病的常见临床体征包括排尿困难和血尿、脓血症、里急后重、腹部疼痛、步态僵硬和败血症。由于临床症状经常重叠，因此在开始治疗之前进行明确的诊断很重要。此外，亚临床前列腺疾病似乎很常见。此前有报道因与前列腺无关的疾病而死亡的狗中亚临床前列腺疾病的组织学患病率为75.6％。最常见的疾病包括BPH（44.8％），前列腺炎（23.6％）和前列腺肿瘤（3.6％）。
缺乏特异性体征和亚临床患者的高发病率都使得区分犬的前列腺增大、感染和肿瘤具有挑战性。超声检查是用于评估前列腺的辅助诊断技术的金标准。它可以区分局灶性或弥散性、异质性、前列腺肥大或囊性改变。此外，可以确定并随时间追踪前列腺的大小和外观。但是，前列腺囊肿或脓肿的超声检查外观可能与前列腺癌相似，必须通过前列腺液分析和/或活检确认诊断。多普勒超声检查可以评估生理和病理状况下的前列腺血管和血流。然而，由于多普勒在评估微血管或深血管中缓慢的血流方面的局限性，因此难以获得对微血管水平的灌注模式的准确评估。近期，用于造影超声（CEUS）的微泡造影剂的推出以及造影剂谐波软件的开发克服了这些限制。微气泡可以灌注微循环血管并放大超声波信号。在兽医医学中，CEUS主要用于肝、脾、肾、胰腺、淋巴结和肾上腺研究。血管模式的分析已显示可以区分犬肝中的良性和恶性结节。
造影剂分布可以评估和描述血管灌注，也可使用专用图像分析软件（Qontrast；Bracco，Milan，Italy）量化血流动力学参数。定量血流动力学参数是信号强度（SI）从基线强度增加到最大SI的百分比（灌注峰值强度[PPI：%]）；超声造影剂开始显现到最大SI的时间（峰值时间[TTP：秒]）；曲线上升阶段（灌注）和下降阶段（清除）的时间（平均通过时间[MTT：秒]）；局部血容量[RBV]与MTT的比值（局部血流量[RBF]）。
一些出版物描述了使用CEUS调查正常和病犬前列腺。但是，尚未评估所有血液动力学参数的造影剂灌注。在这些研究中，对狗进行全身麻醉，这会改变血流的血液动力学。例如，最重要的丙泊酚的心血管作用是低血压，因为心输出量，心肌收缩力，射血分数和全身血管阻力降低。此外，所有气体麻醉剂均会降低心肌收缩力。
因此，我们希望分析未接受全身麻醉的犬在生理和病理条件下的定性前列腺血管模式，并确定定量的血液动力学指标是否可以用作某些前列腺疾病的标志物。
材料和方法
动物
这项研究中使用的所有狗都必须征得主人的知情同意，并且所有程序均按照意大利动物保健法进行。在这项研究中，在24个月内（2011年10月至2013年9月）对26只雄性杂种犬进行了跟踪。八只狗，年龄在2-4岁之间，平均体重为29.3公斤被认为是临床健康的，已证明具有生育能力。18只年龄在4至14岁之间的狗平均体重25.1千克，有不同的前列腺疾病史。招募用于这项研究的犬只接受了标准化的操作规程，包括临床检查，血清化学成分，完整的血细胞计数和尿液分析（数据未显示），前列腺的CEUS和B型超声检查以及超声引导下的活检。前列腺使用TruCut针头穿刺活检。根据临床和组织学发现，将狗分为不同的组。
B超检查
将狗置于侧卧位或仰卧位以进行检查。用线性（4–13MHz）和微凸换能器（6.6–8.0MHz）用于获得前列腺的扫查图像。根据前列腺的大小，边缘，回声性，回声纹理和包膜的完整性进行评估。
超声造影
所有扫查程序均无需全身麻醉。将狗置于侧卧位，并使用配备了超声造影成像技术模块的百胜MyLab70XVisionGold机器。为避免微气泡破裂，使用了具有低机械指数（0.13）的线性传感器（3–8MHz）。使用的超声造影剂是六氟化硫回声信号增强剂（SonoVueBracco系统，米兰，意大利）。在每只狗中，将新配制的造影剂推注剂量（0.03mL/kg体重）通过18G三通阀导管迅速注入头静脉，然后立即注入5mL等渗盐水稀释。由两名经验丰富的操作员执行操作。第一位操作员通过导管静脉注入造影剂，而第二位进行超声扫查。
在每次检查期间，从注射造影剂开始，在超声仪上记录90秒的视频。录制的视频被传输到计算机，随后进行检查和分析。首先评估和描述前列腺灌注过程中的造影剂分配模式。然后，使用专用的图像分析软件（Qontrast;Bracco）对血管灌注参数进行定量。计算出感兴趣区域（ROI）的超声造影时间强度曲线。
该软件以像素为单位计算时间强度曲线，并将其拟合为参数曲线。手动绘制了五条ROI曲线（第一条曲线包括整个前列腺实质，其余部分较小，不包括尿道和囊下区域）。在选定的ROI范围内，从T0开始计算以下参数：PPI（％），TTP（秒），MTT（秒），RBV和RBF（技术1）。另外，为了消除与每只狗的特定心脏循环状况有关的其它变量，从造影剂穿透器官的那一刻起，就对与ROI相关的TTP（秒）和MTT（秒）进行了测量（技术2）。
前列腺活检
在所有的狗中，经腹超声引导前列腺活检是在CEUS检查后进行的。使用盐酸美托咪定（20mg/kg肌肉注射；意大利）对犬进行镇静剂注射，并将其置于仰卧位。前列腺横切面由B型显示，18G半自动活检针（意大利摩德纳市医疗中心）通过腹股沟腹壁插入右侧和左侧前列腺叶的腹侧部分。活检组织按常规方法进行组织学检查。活检样本读数由同一实验室进行。根据组织学表现的严重程度将狗分为不同的病理类型。
统计分析
数值表示为平均标准差或中位数，第一（Q1）和第三（Q3）个四分位数。应用Shapiro-Wilk检验验证了连续变量的正态分布。由于数据分布异常，采用非参数统计分析。为了评估整个前列腺实质、右腹叶和左腹叶以及右背叶和左背叶的测量值是否存在差异，通过估计每个参数的变异系数CV%=（标准差/平均值）×100和Spearman相关系数（ñ）来确定ROIs的样本间变异性。为了探讨两种方法之间的差异，还应用了Bland-Altman的均值差异和Wilcoxon检验。此外，还获得了造影（ROC）曲线下的面积，以评估这两种技术在鉴别良恶性肿块方面的诊断性能。最佳临界值是由曲线上最接近（0，1）的点和使用Excel电子表格的Youden指数确定的。用z检验比较两条ROC曲线下的面积。为了评估不同前列腺疾病患者变量之间的差异，采用Kruskal-Wallis检验，然后采用Mann-WhitneyU检验（如果检测到显著差异），显著性设为P<0.05。统计分析采用SPSSversion20（芝加哥，伊利诺伊州，美国）和GraphPadversion5.0（圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）进行Bland-Altman分析。
结果
患有前列腺疾病的狗有以下一种或多种体征：厌食，体重减轻，体温过高，里急后重，便秘，腹泻，尿痛，尿频，尿频改变，尿失禁，血尿，腹痛，跛行和僵硬步态。根据临床和组织学发现，将犬分为四组：正常前列腺（n=8，对照组），BPH（n=8，BPH组），前列腺炎（n=4，前列腺炎组）和恶性肿瘤（n=6，恶性肿瘤组）。
前列腺超声检查
每次超声检查持续约20分钟以收集所有参数。在对照组中，前列腺的形状和包膜边缘是规则的，实质回声是均一的，质地中等至细腻（表格1)。使用B型超声，在具有病理性前列腺疾病的犬中，在16只犬中发现了前列腺肿大（88.8％；表格1），而其形状则以11只狗（61.1％）保持正常。在17只狗（94.4％）中，观察到了改变的前列腺回声，并且两只狗（16.3％）显示出不连续的包膜。发现了13个实质内病变，其中6个为无回声区，2个为矿化灶，5个为结节性病变。
表格1 狗前列腺的主要B型超声检查结果
符号：+：增加/出现；=：正常；—：减少/缺席；+/-：异质性。
形状：R：规则；I：不规则。
缩写：BPH：良性前列腺增生；Y/N：是/否。
超声造影
定性分析
在所有动物中，CEUS检查均未显示任何副作用，并可以鉴定出不同的前列腺灌注模式。在对照组中，造影剂最初通过前列腺动脉的分支到达前列腺，然后扩散到囊下血管中，从而产生快速的外周边缘增强。随后，CEUS通过实质小动脉到达实质的中部，并逐渐扩散到整个前列腺。特别是在灌注阶段，前列腺表现出完全而均匀的增强。在清除阶段，增强作用持续存在，特别是在包膜周围和尿道周围血管附近。在BPH组中，灌注阶段的特征是同时增强血管，使前列腺出现混乱的血管外观，并且由于空化作用而频繁出现轮廓分明的圆形非血管区域。清除阶段是逐步的和均匀的。前列腺炎组的血管形态与BPH组相似，尽管在灌注阶段，与周围的实质相比，尿道外周血管明显增强（图.1A)。在肿瘤组中，囊下动脉的正常血管模式消失了。患有前列腺腺癌的狗的特征是存在宽直径的动脉，且具有混乱的外观，并且与周围实质相比，在许多区域表现出低回声的结节性血管模式。在两只狗的灌注阶段，可以观察到血管很少或没有血管形成的区域，最有可能是因为坏死的组织。最后，在淋巴瘤病例中，CEUS揭示了造影剂在前列腺内的无序分布，使其在早期灌注阶段表现为血流过多。然而，在清除阶段，前列腺具有异质性的低回声外观，并具有微循环的良好回声特征（图.1D)。
图1.注射造影剂55秒后记录的患有前列腺炎的狗的前列腺的超声造影图像，注意尿道周围血管的持续增强。
（A）患有淋巴瘤的狗的前列腺的超声造影图像。
（B）造影剂注射后十秒钟。微泡的首次出现是在前列腺内。注意微泡的混乱分布。
（C）造影剂注射后十八秒。微泡在整个前列腺内均匀分布，并给器官带来血管增强的外观。
（D）造影剂注射后26秒。清除阶段的特征是微泡增强迅速降低，使病变表现为低回声外观。
定量分析
发现MTT（CV=18.0％）和TTP（CV=19.5％）的ROI间差异低，而RBF和RBV值变化更大（分别为CV=26.2％和31.2％）。但是，对于所有参数，整个前列腺实质与其他ROI之间的相关性都很好（ñ>0.6，P<0.01）。因此，只有整个前列腺实质的参数被考虑作为后续的评估。
技术1与技术2的Bland-Altman分析（图2）显示TTP和MTT的偏差分别为7.8秒和9.4秒（TTP和MTT的一致性限值分别为95%，1.6-17.2和2.0-20.8）。此外，两种方法获得的中位数对TTP和MTT均有不同的影响（P<0.001）。而TTP和MTT的相关系数分别为0.87和0.94（P<0.001）。ROC分析的结果如表2和图3所示。技术1的最佳临界值高于技术2，但两种技术的AUC在TTP（z/40.617；P>0.05）或MTT（z/40.951；P>0.05）中的差异均不显著，显示出相似的临床实用性。利用技术1，我们发现TTP和MTT的临界值分别为40.4和46.7或更低，这有利于鉴别犬前列腺疾病的敏感性。首先，我们评估了正常前列腺（n=8）和患病前列腺（n=8）的灌注参数是否存在差异。病理性前列腺组包括BPH（n=8）、前列腺炎（n=4）和肿瘤（n=6）。前列腺疾病犬的TTP（P<0.01）、RBV（P<0.05）和MTT（P<0.001；表3）较低。其次，我们评估了不同疾病之间的差异。Kruskal-Wallis试验显示TTP（P<0.05）和MTT（P<0.01）存在差异，但它们只与正常前列腺和病理前列腺有关，疾病之间没有差异（表4）。
图2.Bland–Altman显示了通过两种技术获得的达峰时间（TTP;A）和平均通过时间（MTT;B）的差异和平均值，以及95％的一致性。
表2 病理前列腺决定因素（包括BPH，前列腺炎和肿瘤）的参数准确性。
缩写：BPH，良性前列腺增生；MTT，平均通过时间；TTP，达到顶峰的时间。
a阳性，即病理，小于临界值。
图3.使用技术1和2获得的峰值时间（TTP;A）和平均通过时间（MTT;B）的曲线和曲线下面积（AUC）。阳性状态是病理性前列腺。
表3 下表数值是使用技术1计算的整个前列腺实质的中位数（Q1，Q3），该技术适用于正常组和病理组（包括BPH，前列腺炎和肿瘤；n=18）
*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001有显著差异（Mann-WhitneyU检验）。
Peak=灌注强度峰值。
缩写：BPH，良性前列腺增生；CEUS，超声造影剂；MTT，平均通过时间；RBF，局部血流；RBV，局部血容量；TTP，达到顶峰的时间。
表4 下表数值是使用技术1计算的整个前列腺实质的中位数（Q1，Q3），该技术适用于正常组（n=8）、前列腺增生组（n=8）、前列腺炎组（n=4）和前列腺肿瘤组（n=6）。
不共享同一上标的同列数值在P<0.05时有显著差异（Mann-WhitneyU检验）。
Peak=灌注强度峰值。
缩写：CEUS，超声造影剂；MTT，平均通过时间；RBF，局部血流；RBV，局部血容量；TTP，达到顶峰的时间。
讨论
超声造影成像是大约30年前引入的一种诊断工具。从一开始，研究就集中在超声造影剂的开发上。技术的发展使得能够产生由微气泡组成的第二代造影剂，这些微气泡在循环中稳定，穿过肺循环并且对患者没有副作用。
造影剂和超声软件的迅速发展提高了超声检查的灵敏度，不仅可以作为解剖学分析的诊断手段，还可以作为血液动力学研究的研究工具。超声造影创造了新的传统B模式和多普勒超声的机会。实际上，它可以用于实时增加血液回声信号的强度和微泡可以灌注微血管。这样，CEUS可以改善对组织灌注以及器官和血管病变的检测。在人类和兽医学中，CEUS已被用来表征不同器官和组织的血管生理和病理模式：肾上腺，肝脏，脾和前列腺。
前列腺超声对于可视化前列腺内血管至关重要，因为某些情况（例如增生组织或瘤形成）会导致血流模式改变。在人类中，Pummer等报道了使用CEUS作为区分良性和恶性前列腺疾病的工具。在犬中，只有少数研究使用CEUS评估前列腺，而这些研究仅关注血流动力学参数。此外，在其中两项研究中，对狗进行了全身麻醉。
这是对没有全身麻醉的犬通过CEUS评估的不同病理状况下前列腺灌注的定量和定性方面的首次描述。使用CEUS，该研究的定性方面显示正常和病理前列腺的血管模式不同。后者的特征是正常血管外观的改变包括囊下小动脉丢失和向心血管模式缺乏。该研究的定性方面突出了BPH，前列腺炎，腺癌和淋巴瘤之间的不同血管结构。此外，该技术增强了前列腺血管结构的可见性，可用于将结节识别为活检或细针穿刺的目标。最后，在一例淋巴瘤中，增强后期的实时视频显示出微弱的回声变化，这在患有脾淋巴瘤的人类中有报道。
我们的结果表明，通过定量的血液动力学参数，CEUS可用于区分生理性和病理性前列腺。定量研究表明，通过这两种技术，病理前列腺中的TTP和MTT值均显着低于正常前列腺中的TTP和MTT值。但是，它不能区分各种疾病状态。
我们的数据与人类恶性前列腺肿瘤的数据相似。在我们的犬中，增生，前列腺炎和肿瘤组的TTP显着低于对照组（P<0.05）。
Vignoli等发现TTP的差异仅发生于前列腺腺癌。这可能是由于组织异常增生的程度所致。此外，TTP和MTT的临界值在鉴定患有前列腺疾病的狗中显示出高灵敏度和特异性。
根据我们的经验，对血流灌注方式进行定性评估比对血流参数进行定量评估更可靠，从而可以达到临床上有用的诊断。原因之一是超声增强测量值受以下因素的影响：程序（例如，注射方案，心输出量，镇静作用）和个性化的超声设置（例如，机器增益，动态范围，灰度，ROI的实际尺寸）。这导致超声图像的可变性。
该技术的局限性之一是需要经验丰富的超声医师，他能够通过时间强度曲线及其派生参数的分析，从定性和定量的角度解释灌注模式。
结论
超声造影可以成为提高狗前列腺疾病诊断准确性的有价值的非侵入性诊断工具。CEUS的定性方面可以表征BPH，前列腺炎，腺癌和淋巴瘤的血管形态。但是，需要使用大量动物进行进一步研究以证实这些发现。
